Revista Mexicana de Fitopatología, Mexican Journal of Phytopathology

The increasing impact of phloem-restricted bacteria on economically important crops has led to renewed interest in understanding the pathogenesis at the genomic and histological levels of these diseases. The genus Candidatus Liberibacter is associated with economically devastating diseases, highlighting Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) and Candidatus Liberibacter solanaceraum (CLso) in citrus and vegetables. Plant-pathogen interaction studies are limited due to the non-culturable nature of the pathogenic species of the genus Ca. Liberibacter, as well as the lack of experimental models. The objective of this work was to implement a model for the study of bacteria of the genus Candidatus Liberibacter, using tomato-CLso as an experimental model. Through a time course analysis of the tomato-CLso infective process, it was determined that there is a direct correlation between the bacterial load and symptom development, differentiated into early, intermediate and late stages. Additionally, a comparative transcriptional analysis of antibacterial defense marker genes (PR-P1, miR160, and miR393) determined that the response of these genes in the tomato-CLso and lime-CLas pathosystems are equivalent. Our results demonstrate that the tomato-CLso system represents an important model for the study of the interaction between plants and non-cultivable phloem restricted bacteria.

El Huanglongbing (HLB) es una enfermedad considerada como la más destructiva para los cítricos en el mundo, es causada por Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) y diseminada por el vector Diaphorina citri. El HLB ha generado cuantiosas pérdidas económicas en la citricultura mundial. Todas las variedades comerciales de cítricos son susceptibles a esta enfermedad. La naturaleza de CLas como parásito intra celular estricto limitado al floema dificulta el estudio fitopatológico de la enfermedad. Las herramientas “ómicas”, que permiten aplicar análisis comparativos con enfoque masivos, han resultado útiles para describir la interacción entre el agente patogénico y diferentes especies de cítricos, generando conocimiento sobre las bases moleculares de la patogenicidad de CLas y de las respuestas de los hospederos ante la infección. Sin embargo, muchos procesos inmersos en la compleja interacción CLas-cítricos aún no son del todo comprendidos. En la presente revisión se resumen algunos de los principales hallazgos en la última década relacionados con los posibles mecanismos de patogenicidad de CLas a nivel molecular, así como de las respuestas transcripcionales y metabólicas inducidas en cítricos tolerantes o susceptibles, ante la infección. Este conocimiento es necesario para el diseño e implementación de nuevas estrategias para el manejo sustentable de la enfermedad.

La producción de limón persa (LP) es importante para el estado de Veracruz, México. Sin embargo, se ve afectada por el Huanglongbing (HLB), causada por Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), un patógeno biotrófico obligado. LP presenta un cierto nivel de tolerancia al HLB, por tanto, resulta relevante estudiar su respuesta de defensa mediada por ácido salicílico (SA). Tres genes con capacidad de participar en la ruta de respuesta por SA, conocidos como NtSABP, han sido identificados en Nicotiana tabacum; sin embargo, se desconoce la presencia y actividad de dichos genes en LP en respuesta al HLB. En este trabajo se identificaron proteínas homólogas tipo SABP en el transcriptoma de LP y se determinó su grado de expresión diferencial durante la infección con CLas. Se realizó un tBLASTn en el transcriptoma de LP usando como modelo secuencias de las proteínas SABP de cinco diferentes especies, incluyendo N. tabacum. Se reconstruyó y comparó el modelo 3D de las proteínas SABP de N. tabacum y C. latifolia. Con los análisis de tBLASTn, la reconstrucción filogenética y la estructura tridimensional se logró identificar el homólogo directo de cada gen NtSABP en LP. Interesantemente, los genes ClSABP1, ClSABP2 y ClSABP3 mostraron represión en plantas infectadas con CLas. En LP hay al menos un homólogo para cada gen NtSABP. Durante la infección por CLas, estos genes se encuentran ligeramente reprimidos.

Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) se ha dispersado rápidamente a las regiones productoras de cítricos en México, ocasionando impactos económicos y sociales diferenciados. En México, los principales avances en investigación se han centrado en el manejo del vector, Diaphorina citri y en estudios de la interacción de CLas con limón mexicano. Sin embargo, la variabilidad genética de la bacteria en regiones productoras de México se ha estudiado poco. Por lo que, en el presente estudio se analizó la variación de la población mexicana de CLas con procedimientos basados en PCR, secuenciación y electroforesis capilar a través de la detección del número de repeticiones en tándem (TRN) con dos marcadores STR, AGACACA y TACAGAA, el primero localizado en locus genómicos CLIBASIA_01645 y adenosina deaminasas. La distribución de los TRNs en la población mexicana de CLas en ambos loci mostraron variaciones con las poblaciones previamente reportadas en Florida, China y Brasil. Además, en la población mexicana se encontraron tres haplotipos, HA, HB y HC, siendo el primer reporte del haplotipo HC en las regiones citrícolas en México. Interesantemente, las subpoblaciones de CLas del Occidente y Noroeste son diferentes a la del Sureste.

Huanglongbing (HLB) is associated with Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas). It is a destructive disease of citrus. The objective of this study was to determine the genetic diversity of 90 strains of CLas infecting eight citrus species trees from the Central Pacific in Mexico. Genetic diversity among CLas was estimated by fourteen variable numbers of tandem repeat (VNTRs) loci. Three loci were polymorphic, SSR00 and SSR077 amplified four alleles each, while the locus SSR-A amplified two alleles, and the other loci only one allele per locus, resulting in a total of 21 alleles. Dendrogram analysis showed two clusters. No clear genetic structure was found in relation to geographical origin or host. The cluster I was mostly constituted by the majority of CLas strains (82%), but the cluster II comprised twelve strains of CLas collected in Tecoman location, State of Colima, and were obtained from different citrus hosts species. The frequency of 17 haplotypes among strains of CLas from the states of Nayarit, Jalisco, Colima and Michoacán was analyzed; in Colima 14 haplotypes were determinated, while in Michoacan all strains were identified in one haplotype. These results indicate a large genetic diversity among the strains of CLas present in the Central Pacific region in Mexico.

In Mexico, Huanglongbing HLB has become endemic in all Mexican lime producing areas. This disease is transmitted by the insect Diaphorina citri (Hemiptera: Liviidae). The objective of the study was to evaluate different plant extracts and biorational products for the control of D. citri in mexican lime. Two evaluations were made under field conditions; the first one included five treatments, with previous sampling and at 8, 20 and 27 days after the application of the treatments. In the second, eight treatments were evaluated, with prior sampling and at 6, 21 and 27 days. The response variable was the number of D. citri. A completely randomized experimental design with ten repetitions was used. A test of normality and homogeneity of variances was applied to the data, and they were processed through an analysis of variance and separation of means using Tukey (p≤ 0.05). The sweet clover extract (6.0 mL L-1) at 20 days decreased the population density by 59.2%, and Pyrifluquinazon (0.58 mL L-1) at 6 days the decrease was 31.3%. All the extracts showed to be a sustainable alternative for the management of D. citri.

<p>Las bacterias causantes del huanglongbing (HLB), <em>Canditatus</em> Liberibacter spp., son bacterias obligadas al floema de los cítricos y a diferentes sistemas del insecto vector,<em> Diaphorina citri</em>, por lo tanto, el enfoque genómico ha sido útil para estudiar sus mecanismos de patogenicidad. Dicho enfoque ha permitido identificar una copia homóloga del gen codificante de la enzima ATP/ADP translocasa, la cual tiene la capacidad de importar ATP y nucleótidos desde el hospedante, causando un parasitismo de energía considerable. Esta enzima se ha relacionado con la actividad endoparasítica de patógenos animales y humanos más que con fitopatógenos. El presente trabajo analizó la relación evolutiva entre la secuencia de aminoácidos de la ATP/ADP translocasa entre diferentes especies de <em>Ca</em>. Liberibacter y grupos como <em>Ricketssia</em> sp. y <em>Chlamydia</em> sp. Análisis filogenéticos muestran que la variación en la secuencia del gen codificante de la enzima está delimitada en clados correspondientes a las especies de <em>Ca</em>. Liberibacter, sugiriendo que la variación en la enzima responde a un proceso coevolutivo con los hospederos. Asimismo, la filogenia muestra que el ancestro común más cercano a <em>Ca</em>. Liberibacter podría ser un endosimbionte no patogénico del género <em>Ca</em>. Midichloria. Análisis de conservación de la secuencia de aminoácidos muestran que existen varias posiciones en la secuencia que podrían estar relacionadas con la variación específica de esta enzima dentro de <em>Ca</em>. Liberibacter. Este trabajo presenta la hipótesis de que el origen evolutivo de la capacidad de parasitismo energético del género <em>Ca</em>. Liberibacter, causantes del HLB, es un endosimbionte no patogénico.</p>

En Montecillo Texcoco, Estado de México se observaron plantas de margarita (<em>Dimorphotheca</em> <em>sinuata</em>) exhibiendo síntomas de filodia, virescencia y proliferación de ramas axilares putativos a los inducidos por fitoplasmas.  Por lo que el objetivo de esta investigación fue detectar el fitoplasma asociado a estos síntomas mediante PCR con los iniciadores P1/P7 y R16F2n/R2. Se detectó la presencia de fitoplasmas en tejido foliar sintomático. El producto de PCR de 1200 pb obtenido de la PCR  se secuenció y sometió a digestión con las enzimas de restricción MseI (Tru91), AluI, Kpn1 y HaIII, los patrones de restricción evidenciaron que el fitoplasma presente en <em>Dimorphotheca</em> <em>sinuata</em> es <em>Candidatus</em> phytoplasma asteris (16SrI). Las secuencias obtenidas fueron depositadas en la base de datos del NCBI y tuvieron una similitud del 99% con <em>Candidatus</em> phytoplasm asteris grupo 16Sr1-B de Irán (MH638316.1). Se realizó un análisis filogenético con el método de Neighbour-Joining, en el cual el aislamiento detectado en margarita, se agrupó con <em>Candidatus</em> phytoplasma asteris. De acuerdo con los síntomas observados en campo, análisis de patrones de restricción, secuenciación y filogenia, indican que la filodia en margarita está asociada a <em>Candidatus</em> phytoplasma asteris, relacionado filogenéticamente al grupo 16Sr1-B.

El Huanglongbing representa un gran reto para su control, por lo que se requiere de alternativas efectivas a la aplicación de insecticidas al insecto vector. La inducción de resistencia sistémica es una alternativa para disminuir el progreso de la enfermedad en árboles infectados. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de inductores de resistencia sistémica sobre la concentración de <em>?Candidatus</em> Liberibacter asiaticus? (CLas) en árboles de limón mexicano (Lm) en condiciones de invernadero. Los inductores de resistencia utilizados fueron ácido salicílico (T1), <em>Azospirillum brasilense</em> Cd (T2) y quitosano (T3), aplicados cada 20 días durante ocho meses. La cuantificación de CLas fue mediante qPCR. La concentración de CLas se determinó a los 1, 2, 5 y 8 meses pos-tratamiento. A los 8 meses pos-tratamiento, T1 y T3 no presentaron diferencias postratamiento en la reducción postratamiento de la concentración de CLas con respecto al control sin inductor (T4) (6.5×103 células bacterianas/100 ng de ADN), mientras que T2 disminuyó casi tres veces la concentración de CLas con respecto al control. La inoculación directa al suelo de <em>A. brasilense</em> Cd mostró un efecto significativo en la reducción de la concentración de CLas en los árboles de Lm en condiciones de invernadero.

El objetivo fue determinar diferencias en la actividad enzimática antioxidante y la concentración de fenoles totales en plantas de limón mexicano (Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle), limón persa (Citrus latifolia Tanaka); y naranja dulce Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck), infectadas bajo condiciones naturales de campo con Candidatus Liberibacter asiaticus (CaLas), en Bustamante, Tamaulipas, México. Se determinó la presencia de CaLas por qPCR; la actividad enzimática de fenilalanina amonio liasa (PAL), que se activa ante el ataque de patógenos; peroxidasa que interviene en la lignificación de paredes como respuesta a la infección; α-amilasa que degrada el almidón y se acumula en el tejido vascular, y compuestos fenólicos que cumplen funciones de defensa. Se realizó un análisis de contrastes. La concentración de proteínas totales mostró diferencias significativas entre especies entre especies (P< 0.0001). Con una media de 6.1 y 6.37 mg de proteínas por g de tejido fresco para árboles infectados de limón mexicano; y naranja dulce negativa a CaLas. La actividad peroxidasa presentó diferencia significativa para limón persa (P=0.0341), con una media de 1.96 U.mg de proteína-<sup>1</sup>. En naranja dulce se observó mayor actividad de α amilasa en los árboles infectados por CaLas (1.19 U.mg de proteína-<sup>1</sup>). La concentración de PAL y fenoles totales no presentaron diferencias significativas entre especies. En el presente estudio se observó que CaLas influye en la actividad enzimática de cítricos.