AbstractPhytoplasmas are bacteria transmitted by insects that can cause plant diseases. In Bogotá 'Candidatus Phytoplasma asteris' and ' Candidatus Phytoplasma fraxini', infect 11 species of urban trees, weeds, grass, potato and strawberry. A set of primers, that amplify both phytoplasmas species were designed and used for absolute and relative qPCR quantification of the 16SrRNA gene. The primers AJ-16Sr-F/AJ-16Sr-R allowed the amplification of ‘Ca. P. asteris’, ‘Candidatus Phytoplasma palmae’, ‘Ca. P. fraxini’ and ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’, not of ‘Candidatus Phytoplasma pruni’. Absolute qPCR detected phytoplasmas between 1 × 109 and 1 × 103 copies/μL DNA extract. Two species-specific hydrolysis probes, AJ-16SrI-Cy5.5 and AJ-16SrVII-TexRed, were designed to detect 'Ca. P. asteris' and 'Ca. P. fraxini' respectively, using the AJ-16Sr-F/AJ-16Sr-R primers. For relative quantification, the 18SrRNA gene was used as normalizer. Relative qPCR detected phytoplasmas between 1 × 109 and 1 × 103 copies/μL DNA extract. Multiplex reactions allowed the specific quantification of 'Ca. P. asteris', 'Ca. P. fraxini' in comparison to the normalizer. qPCR methods were validated on natural hosts Andean oak trees and leafhoppers. The relative quantification values were higher for 'Ca. P. fraxini' (x̅ RQ = 3203.1 ± 2622,9 n = 14) compared with 'Ca. P. asteris' (x̅ RQ = 14.9 ± 24,5 n = 6) in oak tree samples. In the leafhoppers, the relative quantification values ranged between RQ = 26.5 and RQ = 294,927.3 for 'Ca. P. fraxini’ and RQ = 34.8 and RQ = 1722.2 for 'Ca. P. asteris'. In conclusion, although absolute qPCR allowed the quantification of phytoplasmas by comparing Cq (quantification cycle) values of samples with a standard curve, it did not allow to differentiate between 'Ca. P. asteris' and 'Ca. P. fraxini'. In contrast, relative qPCR assays using specific hydrolysis probes allowed the specific detection and quantification of each phytoplasma, in individual and mixed infections in insect vectors and plant hosts.
La producción de limón persa (LP) es importante para el estado de Veracruz, México. Sin embargo, se ve afectada por el Huanglongbing (HLB), causada por Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), un patógeno biotrófico obligado. LP presenta un cierto nivel de tolerancia al HLB, por tanto, resulta relevante estudiar su respuesta de defensa mediada por ácido salicílico (SA). Tres genes con capacidad de participar en la ruta de respuesta por SA, conocidos como NtSABP, han sido identificados en Nicotiana tabacum; sin embargo, se desconoce la presencia y actividad de dichos genes en LP en respuesta al HLB. En este trabajo se identificaron proteínas homólogas tipo SABP en el transcriptoma de LP y se determinó su grado de expresión diferencial durante la infección con CLas. Se realizó un tBLASTn en el transcriptoma de LP usando como modelo secuencias de las proteínas SABP de cinco diferentes especies, incluyendo N. tabacum. Se reconstruyó y comparó el modelo 3D de las proteínas SABP de N. tabacum y C. latifolia. Con los análisis de tBLASTn, la reconstrucción filogenética y la estructura tridimensional se logró identificar el homólogo directo de cada gen NtSABP en LP. Interesantemente, los genes ClSABP1, ClSABP2 y ClSABP3 mostraron represión en plantas infectadas con CLas. En LP hay al menos un homólogo para cada gen NtSABP. Durante la infección por CLas, estos genes se encuentran ligeramente reprimidos.
El Huanglongbing (HLB) es una enfermedad considerada como la más destructiva para los cítricos en el mundo, es causada por Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) y diseminada por el vector Diaphorina citri. El HLB ha generado cuantiosas pérdidas económicas en la citricultura mundial. Todas las variedades comerciales de cítricos son susceptibles a esta enfermedad. La naturaleza de CLas como parásito intra celular estricto limitado al floema dificulta el estudio fitopatológico de la enfermedad. Las herramientas “ómicas”, que permiten aplicar análisis comparativos con enfoque masivos, han resultado útiles para describir la interacción entre el agente patogénico y diferentes especies de cítricos, generando conocimiento sobre las bases moleculares de la patogenicidad de CLas y de las respuestas de los hospederos ante la infección. Sin embargo, muchos procesos inmersos en la compleja interacción CLas-cítricos aún no son del todo comprendidos. En la presente revisión se resumen algunos de los principales hallazgos en la última década relacionados con los posibles mecanismos de patogenicidad de CLas a nivel molecular, así como de las respuestas transcripcionales y metabólicas inducidas en cítricos tolerantes o susceptibles, ante la infección. Este conocimiento es necesario para el diseño e implementación de nuevas estrategias para el manejo sustentable de la enfermedad.
Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) se ha dispersado rápidamente a las regiones productoras de cítricos en México, ocasionando impactos económicos y sociales diferenciados. En México, los principales avances en investigación se han centrado en el manejo del vector, Diaphorina citri y en estudios de la interacción de CLas con limón mexicano. Sin embargo, la variabilidad genética de la bacteria en regiones productoras de México se ha estudiado poco. Por lo que, en el presente estudio se analizó la variación de la población mexicana de CLas con procedimientos basados en PCR, secuenciación y electroforesis capilar a través de la detección del número de repeticiones en tándem (TRN) con dos marcadores STR, AGACACA y TACAGAA, el primero localizado en locus genómicos CLIBASIA_01645 y adenosina deaminasas. La distribución de los TRNs en la población mexicana de CLas en ambos loci mostraron variaciones con las poblaciones previamente reportadas en Florida, China y Brasil. Además, en la población mexicana se encontraron tres haplotipos, HA, HB y HC, siendo el primer reporte del haplotipo HC en las regiones citrícolas en México. Interesantemente, las subpoblaciones de CLas del Occidente y Noroeste son diferentes a la del Sureste.
Huanglongbing (HLB) is one of the most destructive diseases in citrus, which imperils the sustainability of citriculture worldwide. The presumed causal agent of HLB, ‘<i>Candidatus</i> Liberibacter asiaticus’ (CLas) is a non-culturable phloem-limited α-proteobacterium transmitted by Asian citrus psyllids (ACP, <i>Diaphorina citri</i> Kuwayama). A widely adopted method for HLB diagnosis is based on quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). Although HLB diagnostic qPCR provides high sensitivity and good reproducibility, it is limited by time-consuming DNA preparation from plant tissue or ACP and the requirement of proper lab instruments including a thermal cycler to conduct qPCR. In an attempt to develop a quick assay that can be deployed in the field for CLas detection, we developed a real-time loop-mediated isothermal amplification (rt-LAMP) assay by targeting the CLas five copy <i>nrd</i>B gene. The rt-LAMP assay using various plant sample types and psyllids successfully detected the <i>nrd</i>B target as low as ~2.6 Log<sub>10</sub> copies. Although the rt-LAMP assay was less sensitive than laboratory-based qPCR (detection limit ~10 copies), the data obtained with citrus leaf and bark and ACP showed that the rt-LAMP assay has >96% CLas detection rate, compared to that of laboratory-based qPCR. However, the CLas detection rate in fibrous roots was significantly decreased compared to qPCR due to low CLas titer in some root DNA sample. We also demonstrated that the rt-LAMP assay can be used with a crude leaf DNA extract which is fully deployable in the field for quick and reliable HLB screening.